Vorbereitungsphase: In diesem Anfangsstadium wird ein Zuckermolekül mit 6 Kohlenstoffatomen (normalerweise Glucose) zweimal phosphoryliert, um Fructose-1,6-bisphosphat zu bilden. Dieser Prozess erfordert die Eingabe von 2 ATP-Molekülen und nutzt die Enzyme Hexokinase und Phosphofructokinase.
Spaltungsphase: In dieser Phase wird Fructose-1,6-bisphosphat in zwei 3-Kohlenstoff-Zucker gespalten:Glycerinaldehyd-3-phosphat (GAP) und Dihydroxyacetonphosphat (DHAP). Diese beiden Moleküle sind ineinander umwandelbar und können beide auf dem Weg weiter voranschreiten.
Auszahlungsphase: In dieser letzten Phase werden GAP und DHAP in Pyruvat umgewandelt, wodurch ATP und NADH entstehen. Diese Stufe besteht aus mehreren enzymatischen Schritten, einschließlich Phosphorylierungs- und Oxidationsreaktionen auf Substratebene. Letztendlich werden für jedes Glucosemolekül, das in die Glykolyse eintritt, 2 Pyruvatmoleküle sowie insgesamt 4 ATP- und 2 NADH-Moleküle produziert.